Protocoles
Reconstituer un peptide lyophilisé : le protocole
Le solvant, la vitesse d’ajout et le nombre de cycles de congélation expliquent la majorité des pertes d’activité observées en paillasse.
La reconstitution est l'étape où l'on perd le plus de matériel, et presque toujours pour des raisons évitables. Un peptide lyophilisé correctement stocké est stable pendant des années ; mal remis en solution, il peut perdre une part importante de son activité en quelques minutes.
Avant d’ouvrir le flacon
Sortez le flacon du congélateur et laissez-le atteindre la température ambiante avant de le déserrir — comptez vingt à trente minutes. Ouvrir un flacon froid fait condenser l'humidité ambiante directement sur le lyophilisat : l'eau captée amorce l'hydrolyse et, pour les séquences contenant de la méthionine ou de la cystéine, l'oxydation.
Centrifugez brièvement le flacon (quelques secondes à faible vitesse) avant ouverture. Le lyophilisat est une poudre légère qui adhère au bouchon et aux parois pendant le transport ; sans cette étape, une fraction non négligeable du contenu part avec le bouchon.
Choisir le solvant
Le solvant se choisit d'après la charge nette de la séquence au pH neutre, que l'on estime en comptant les résidus ionisables : Asp (D) et Glu (E) comptent −1, Lys (K), Arg (R) comptent +1, His (H) compte +0,5 environ.
| Charge nette estimée | Solvant de première intention | Remarque |
|---|---|---|
| Basique (nette positive) | Eau stérile ou eau bactériostatique | Se dissout en général directement. |
| Acide (nette négative) | NH₄OH dilué (0,1 %) puis dilution aqueuse | Ajouter la base goutte à goutte. |
| Neutre / hydrophobe | DMSO ou acide acétique 10–30 %, puis dilution | Vérifier la compatibilité du DMSO avec le test en aval. |
| Riche en Cys | Solvant dégazé, éviter le DMSO | Le DMSO favorise la formation de ponts disulfure. |
Le geste
- Calculez le volume : pour obtenir 1 mg/mL à partir d’un flacon de 5 mg, ajoutez 5 mL.
- Faites couler le solvant lentement sur la paroi interne du flacon, jamais directement sur la poudre.
- Inclinez et faites tourner doucement le flacon jusqu’à dissolution complète.
- Ne vortexez pas et ne secouez pas : l’agitation vigoureuse crée une interface air-liquide qui dénature les peptides longs et fait mousser les séquences amphipathiques.
- Si la dissolution est incomplète après cinq minutes, passez au bain à ultrasons quelques secondes plutôt que d’augmenter l’agitation.
Après reconstitution
Aliquotez immédiatement en volumes correspondant à une seule expérience, puis congelez à −20 °C, ou à −80 °C au-delà d'un mois. C'est le point le plus important de ce protocole : chaque cycle de congélation-décongélation dégrade le peptide, et une solution mère décongelée dix fois n'a plus grand-chose à voir avec celle du premier jour.
Utilisez des tubes à faible adsorption pour les peptides très hydrophobes ou les concentrations inférieures au micromolaire : l'adsorption sur le plastique fait disparaître une fraction mesurable du produit, ce qui se lit ensuite comme une perte d'activité.